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chroma意為“色彩”，graphy源自希臘文，意為“寫(xiě)”。色譜為層析的同義語(yǔ)，都是從英語(yǔ)chromatography譯來(lái) 的。

層析（色譜） chromatography

在把微細分散的固體或是附著(zhù)于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱(chēng)為層析，亦稱(chēng)色譜法。根據移動(dòng)相種類(lèi)的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著(zhù)適當的液體，也可使用其他物質(zhì)。將作為固定相的微細粉末狀物質(zhì)裝入細長(cháng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱(chēng)為柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質(zhì)作為固定相的稱(chēng)為薄層層析（thin-layer chromatography），后者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進(jìn)行同樣的分析，即在固定相的一端，點(diǎn)上微量試料，在密閉容器中，使移動(dòng)相（液體）從此端滲入，移動(dòng)接近另一端。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據Rf值的測定進(jìn)行鑒定。當斑點(diǎn)不易為肉眼觀(guān)察時(shí)，可利用適當的顯色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀(guān)察。也可采用在第一種移動(dòng)相展開(kāi)后再用另一移動(dòng)相進(jìn)行展開(kāi)（這時(shí)的展開(kāi)方向應與原方向垂直），使各成分分離完全的雙向層析（two-dimensional chromatography）。分離后，將斑點(diǎn)位置的固定相切取下來(lái)，把其中含有來(lái)自試料的物質(zhì)提取進(jìn)行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動(dòng)相從加入試料的一端展開(kāi)到達另一端后，繼續展開(kāi)使各成分和移動(dòng)相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層析（elution chromatography）。層析根據固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離子交換層析）等三種類(lèi)型。但這并不是很?chē)栏竦?，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類(lèi)型。此外，近來(lái)也應用親和層析，即將與基質(zhì)類(lèi)似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質(zhì)。

◆按層析的機理劃分：

吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等。

吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。

分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。

離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。

凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。

◆按流動(dòng)相與固定相的不同劃分：

氣相層析、液相層析。這兩大類(lèi)層析是以流動(dòng)相不同來(lái)劃分的。如同時(shí)區分流動(dòng)相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。

◆按操作形式劃分：

柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。

柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達到分離。

紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達到分離鑒定的目的。

薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。

以上劃分無(wú)嚴格界限，有些名稱(chēng)相互交叉，如親和層析應屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。

層析須在兩相系統間進(jìn)行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動(dòng)相，是液體或氣體。當流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，被分離物質(zhì)在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過(guò)程。隨著(zhù)流動(dòng)相不斷向前流動(dòng)，被分離物質(zhì)間出現向前移動(dòng)的速率差異，由開(kāi)始的單一區帶逐漸分離出許多區帶，這個(gè)過(guò)程叫展層。

系數K是物質(zhì)在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質(zhì)間的K值差別大，則易被分離。不同類(lèi)型層析的K值含義不同，可視為吸附平衡常數，分配常數或離子交換常數等。

研究層析現象而發(fā)展的塔板理論，與有機化學(xué)實(shí)驗中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機溶劑在分餾柱內的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點(diǎn)溶劑先分餾出來(lái)，達到純化的目的。在層析時(shí)用理論塔板數n來(lái)衡量層析效能。

tR為物質(zhì)在層析柱上的保留時(shí)間，W為洗脫下來(lái)的物質(zhì)峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長(cháng)度的因子。

式中L為層析柱的柱長(cháng)。H值越大，則柱效越低。

此外影響層析分離效果的還有渦流擴散、縱向擴散和傳質(zhì)阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動(dòng)相的層析系統和溫度等都是做好層析的關(guān)鍵。

◆吸附層析

吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來(lái)決定。被吸附物的化學(xué)結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機溶劑的有機化合物的分離，較少用于無(wú)機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統，以獲得最佳分離效果。

◆分配層析

在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質(zhì)能儲留相當量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時(shí)就會(huì )形成以不同速度向前移動(dòng)的區帶。

◆離子交換層析

支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽(yáng)離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽(yáng)離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機物和無(wú)機物。對于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周?chē)芤旱碾x子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時(shí)，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來(lái)。洗脫過(guò)程中，按K值不同，分成不同的區帶。

◆凝膠過(guò)濾層析

支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周?chē)乃疄橥馑畬??？刂?a href=http://baike.baidu.com/view/1461879.htm target=_blank>交聯(lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結構。交聯(lián)度小的孔徑大，交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進(jìn)入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來(lái)。而進(jìn)入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區帶。選擇不同規格的凝膠，可把一個(gè)混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱(chēng)為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。

◆親和層析

在一對有專(zhuān)一的相互作用的物質(zhì)中，把其中之一聯(lián)結在支持物上，用于純化相對的另一物質(zhì)。常見(jiàn)的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。

◆氣相層析

屬于分配層析或吸附層析，僅適用于分析分離揮發(fā)性和低揮發(fā)性物質(zhì)。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點(diǎn)液體，如硅油、高沸點(diǎn)石蠟和油脂、環(huán)氧類(lèi)聚合物。外涂層約為支持物重量的20%。分析時(shí)操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動(dòng)相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區帶十分清晰，是由于揮發(fā)性物質(zhì)在兩相間能很快達到平衡，所需分析時(shí)間大為縮短，一般為數分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點(diǎn)。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過(guò)冷凍將分離物回收的裝置。

◆紙層析

以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì)，能形成水相和展層溶劑的兩相系統，被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關(guān)系。紙層析用于分析簡(jiǎn)單的混合物時(shí)可做單向層析。對于復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開(kāi)創(chuàng )了近代層析的發(fā)展和應用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。

◆薄層層析

在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據需要做不同類(lèi)型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中，涂在滌綸片基上，當甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過(guò)了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時(shí)間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時(shí)間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿(mǎn)意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時(shí)，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。

◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）

70年代新發(fā)展的層析法。其特點(diǎn)是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當于34個(gè)標準大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應生成Si—Cl，進(jìn)一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽(yáng)離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學(xué)性能穩定。用不同類(lèi)型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時(shí)間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質(zhì)。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質(zhì)，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進(jìn)的分析儀器，在生物化學(xué)、化學(xué)、醫藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。

◆反相層析

在吸附層析中，高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢，洗脫時(shí)發(fā)生拖尾現象和保留時(shí)間長(cháng)的問(wèn)題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類(lèi)，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質(zhì)不被吸附，最先洗下來(lái)，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱(chēng)為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。

◆同系層析

在核酸分析中，將樣品經(jīng)核酸酶部分裂解成不同長(cháng)度的核苷酸片段，用同位素標記后，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過(guò)的核苷酸推進(jìn)，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。于是把這種層析法稱(chēng)為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用于寡核苷酸的順序分析。

紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開(kāi)始.層析法又稱(chēng)色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數（或稱(chēng)分配常數）不同，達到彼此分離的目的。

層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類(lèi)似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上?，F在，它在石油、化工、醫藥衛生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著(zhù)十分重要的作用。

層析根據固定相基質(zhì)的形式分類(lèi)，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。

在層析技術(shù)發(fā)展之初，對于一些物質(zhì)的分離方式都處在比較原始的狀態(tài)，并且分離的結果也并不是很理想。
　　bio-rad專(zhuān)家談到層析技術(shù)最初是在1903~1906年由俄國植物學(xué)家M.Tswett首先提出來(lái)的。
　　那時(shí)，他將葉綠素的石油醚溶液倒入碳酸鈣管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于碳酸鈣對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，所以色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同的色譜圖。于是就稱(chēng)這種混合物的分離方法為，有色的圖譜法（Chromato+graphy），簡(jiǎn)稱(chēng)色譜法，又叫層析法。不過(guò)，當時(shí)這種方法并未引起人們的注意。

接下來(lái)隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。這里就不得不提到兩位在層析技術(shù)發(fā)展史上做出重要貢獻的人，他們是英國生物學(xué)家馬?。∕artin）和辛格（Synge）。是他們首先提出了色譜塔板理論。

色譜塔板理論其實(shí)是基于熱力學(xué)近似的理論，這個(gè)理論中涉及的對象有目標分離物，色譜柱。這里色譜柱好比是一個(gè)分餾塔。理論是這樣的：將目標分離物倒入“分餾塔”，這樣就會(huì )在分餾塔板間移動(dòng)，在每一個(gè)塔板內組分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著(zhù)流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡。一個(gè)色譜柱的塔板數越多，則其分離效果也就越好。這個(gè)分離過(guò)程提升分離效率，并且定量的進(jìn)行描述，分析這個(gè)分離過(guò)程。
　　這是個(gè)進(jìn)步，并且馬?。∕artin）和欣革（Synge）還提出更為遠見(jiàn)卓識的預言：1、流動(dòng)相可用氣體代替液體，因為與液體相比，分離時(shí)候，物質(zhì)間作用力更小，對分離也就更有好處。2、若能夠使用非常細的顆粒填料，并在色譜柱兩端施加較大的壓差，從而增加了理論培板數，這將會(huì )大大提高分離效率。

上世紀60、70年代是色譜/層析技術(shù)快速發(fā)展的時(shí)代，首先是層析介質(zhì)有了飛速的發(fā)展，各種人工合成的介質(zhì)出現，如硅膠、聚苯乙烯二乙烯基樹(shù)脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等樹(shù)脂或凝膠的出現，極大地拓展了層析技術(shù)的應用領(lǐng)域和范圍，基于不同介質(zhì)的層析方法也如雨后春筍般不斷涌現。

色譜法或是層析法是簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，就是依據被分離物的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。^[1]